خصائص البروتين K ، النشاط الأنزيمي والتطبيقات

ال بروتيناز ك هو إنزيم ينتمي إلى مجموعة البروتياز السيريني ، أي أنه يحتوي في مركزه الحفاز النشط على سيرين حمض أميني وله وظيفة كسر الروابط الببتيدية بواسطة التحلل المائي. بدوره ينتمي هذا الإنزيم إلى عائلة البروتينات subtilisins (ببتيداز S8).

البروتيناز K له وزن جزيئي (MW) يبلغ 28،900 دالتون وتم عزله لأول مرة في عام 1974 من مستخلصات الفطريات. ألبوم Engyodontium, المعروف سابقا باسم الألبوم Tritirachium ليمبر.

يقدم قدرة عالية من البروتين ، أثبت أنه قادر على تحطيم وجود الكيراتين في الشعر. تتم كتابة كلمة الكيراتين باللغة الإنجليزية "كيراتين" ، ومن هنا جاءت تسميتها "بروتيناز ك".

نظرًا لقدرته العالية على تشق البروتينات الأصلية ، فإن هذا الإنزيم مفيد في العديد من تقنيات البيولوجيا الجزيئية. يستخدم بشكل رئيسي لعزل وتحضير الأحماض النووية ذات الوزن الجزيئي العالي (MW).

يعمل Proteinase K بإطلاق الحمض النووي النووي ، بينما يدمر البروتينات ويثبط نشاط RNases و DNase ، أي يزيل الخلايا النووية في تحضير الحمض النووي الريبي DNA..

من ناحية أخرى ، فقد لوحظ أن البروتيناز K يمكنه تحلل بعض البروتينات الأصلية المشوهة ، مما أثار اهتمام الباحثين لاستخدامه في دراسة بروتينات البريون (PrPC).

ومع ذلك ، على الرغم من قوته العالية للبروتين ، توجد بروتينات تقاوم عمل البروتيناز K. ومن بين هذه ، هناك بعض البروتينات الشاذة تسمى بريونس (PrPSc) ، المرتبطة بالتهاب الدماغ الإسفنجي المنقول..

مؤشر

• 1 خصائص البروتيناز ك
• 2 النشاط الأنزيمي
• 3 تطبيقات
• 4 مزايا بروتيناز ك
• 5 بروتينات مقاومة للبروتين
• 6 المراجع

خصائص البروتيناز ك

يحتوي Proteinase K على بنية ثلاثية مكونة من ثلاث طبقات ، مع ورقة مكونة من سبع سلاسل تتخللها طبقتان من الحلزونات. نظرًا لأنه ينتمي إلى عائلة الببتيداز S8 ، فإنه يتميز بوجود ثالوث محفز في موقعه النشط ، وترتيبه المتسلسل هو (Asp و His and Ser) ، والذي يميزهم عن عائلات الببتيداس الأخرى..

يتميز هذا الإنزيم من مجموعة البروتياز سيرين بتحلل الروابط الببتيد على مقربة من المجموعة الكربوكسيلية من الأحماض الأمينية الأليفاتية والعطرية.

من ناحية أخرى ، فهي قادرة على العمل في وجود بعض المواد المسببة للتآكل ، مثل كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) ، تريس- HCL و EDTA ، والتي تستخدم للمساعدة في تمسخ البروتينات ، مما يؤدي إلى فقدان بنيتها الأصلية..

هذه هي خطوة أولية في إعداد البروتينات لتقنية الكهربائي. يكون نطاق الأس الهيدروجيني الذي يعمل عنده بروتيناز K واسعًا جدًا (من 2 إلى 12.0) ، مع درجة الحموضة المثلى بين 7.5 إلى 12.0 ، ونقطة تساوي الجهد الكهربي هي 8.9. كما يمكن ملاحظته ، فهو فعال ضد مجموعة واسعة جدًا من الأس الهيدروجيني.

ميزة أخرى تبرز في بروتيناز K هي ثباتها في وجود درجات حرارة عالية (50 - 60 درجة مئوية).

النشاط الأنزيمي

يحتاج البروتيناز K إلى وجود أيون الكالسيوم ، على الرغم من أن هذا لا يؤثر على نشاطه ، إذا كان من الضروري الحفاظ على استقراره.

لتنفيذ البروتيناز K عملية الهضم الكاملة للركيزة ، من الضروري وجود وقت اتصال تقريبي يتراوح بين 5 دقائق وساعتين..

ومع ذلك ، بهذا المعنى ، قارن Daza et al. نقاء الحمض النووي الذي تم الحصول عليه في عدة مرات من التعرض للبروتيناز K ، وخلص إلى أن الحضانة المطولة (حتى 24 ساعة) تحسن بشكل كبير من جودة الحمض النووي..

الآن ، فيما يتعلق بالتركيز المستخدم في إنزيم البروتيناز K في البروتوكولات المختلفة ، يمكن القول أنه متنوع للغاية.

يمكن استخدامه من تركيزات منخفضة للغاية (5 ميكروغرام / مل) إلى تركيزات 500 ميكروغرام / مل. لكن تركيزات العمل الأكثر تكرارًا تتراوح بين 50-100 ميكروغرام / مل ، خاصة بالنسبة لهضم البروتين وتعطيل نوكلياز. على الرغم من أن تركيز 2 ملغ / مل مطلوب لعلاج الأنسجة.

تطبيقات

تطبيقاته واسعة جدًا ويمكن تلخيصها فيما يلي:

-يتم استخدامه في هضم البروتين واستخراج الحمض النووي بعدة طرق مثل: التمليح ، PK-SDS ، بروميد سيتيل - تريميثيل الأمونيوم (CTAB) ، خلات البوتاسيوم المعدلة واستخراجها مع يوديد الصوديوم..

-إبطال نشاط nucleases (RNases و DNases).

-في تقنية التهجين في الموقع (HIS) ، للمساعدة في إطلاق الحمض النووي ، بالإضافة إلى التخلص من البروتينات غير المرغوب فيها.

-تعديل البروتين.

-على مستوى البحث ، في الدراسات المختلفة.

مزايا البروتيناز ك

تم إجراء العديد من الدراسات المقارنة بين تقنيات استخراج الحمض النووي باستخدام Proteinase K ، مع دراسات أخرى لا تستخدمه وتخلص جميعها إلى أن هناك فوائد أكبر عند استخدام الإنزيم. من بين المزايا ، يمكن ذكر ما يلي:

-يتم الحصول على الحمض النووي عالي الوزن الجزيئي عالي الجودة والنقاء.

-الحمض النووي المستخرج مستقر حتى 3 أشهر.

يمكن استخدام الحمض النووي المستخرج في التقنيات التالية: لطخة جنوبية ، تفاعل سلسلة بوليميريز (PCR) ، رحلان كهربائي ، من بين أشياء أخرى.

البروتينات المقاومة للبروتيناز ك

خلصت العديد من التحقيقات إلى أن البريونات (البروتينات السامة غير الطبيعية لـ PRPSc) تختلف عن بروتينات PrPC (الأم) لأنها مقاومة لعمل البروتيناز K ، في حين أن PRPC حساس لعملها.

وصف مؤلفون آخرون أنه في بنية PrPSc توجد أجزاء حساسة وأخرى مقاومة للبروتيناز K. ومع ذلك ، فإن كلا الجزأين سامة ومعدية على حد سواء..

من ناحية أخرى ، قام باستيان والمتعاونون في عام 1987 بعزل 4 بروتينات من 28 و 30 و 66 و 76 كيلو دالتون من نوع من سبيروبلازما ميروم. كانوا جميعًا مقاومين لعمل البروتيناز K وكان لديهم أيضًا تفاعل متقاطع مع بعض البريونات.

من المعروف أن هذا النوع يمكن أن يسبب إعتام عدسة العين والأضرار العصبية الهامة وبسبب النتائج العلمية لباستيان ، من بين التحقيقات الأخرى ، بذلت محاولة لربط هذه الكائنات الحية الدقيقة بالتهاب الدماغ الإسفنجي المنقول.

ومع ذلك ، فإن مسببات هذه الأمراض العصبية التنكسية لا تزال تنسب إلى البريونات اليوم.

بهذا المعنى ، قام بتلر والمتعاونون في عام 1991 بتحديد وتميز فئة من 40 Kda بروتين مقاوم للبروتين K من سلالتين من الميكوبلازما الزهري. يؤثر هذا الممرض على الخنازير ، ويصيب أنسجته ، ولكن في هذه الحالة لم يكن هناك تفاعل متقاطع مع البريونات المختبرة.

هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتوضيح العديد من المجهولين حول هذا الموضوع.

مراجع

1. باستيان إف ، جينينغز آر ، وغاردنر دبليو 1987. مضاد تفاعل البروتين الليفي المرتبط بالبراغي يتفاعل مع سبيروبلازما ميروم بروتينات ليفية. جيه كلين Microbiol. 25: 2430-2431.
2. Daza C، Guillen J، King J، Ruiz V. تقييم طريقة استخراج الحمض النووي وتنقيته من الأنسجة العضلية الثابتة في الفورمالدهايد من جثث مجهولة الهوية.  مجلة ميد, 2014؛ 22 (1): 42-49,
3. Butler G، Kotani H، Kong L، Frick M، Evancho S، Stanbridge E، and Mcgarrity G. Identification and Characterification of Proteinase K-Resistant Proteins in Members of Class Mollicutes. العدوى والمناعة ، 1991 ، 59 (3): 1037-1042
4. López M، Rivera M، Viettri M، Lares M، Morocoima A، Herrera L، et al. مقارنة بين اثنين من البروتوكولات لاستخراج الحمض النووي من داء المثقبيات كروز نمت في وسط محوري. القس بيرو. ميد. إكسب. الصحة العامة  2014؛ 31 (2): 222-227. متاح في: scielo.org
5. Jiménez G، Villalobos M، Jiménez E و Palma W. تحديد فعالية خمسة بروتوكولات استخراج الحمض النووي من مادة البارافين للدراسات الجزيئية. القس ميد جامعة كوستاريكا. 2007؛ 1 (1): 10-19.