وظائف تقييد الانزيمات ، وآلية العمل ، والأنواع والأمثلة

ال تقييد الانزيمات هي نوكلياز تستخدم من قبل بعض الآثار القديمة والبكتيريا لمنع أو "تقييد" انتشار الفيروسات داخلها. وهي شائعة بشكل خاص في البكتيريا وهي جزء من نظامها الدفاعي ضد الحمض النووي الأجنبي المعروف باسم نظام التقييد / التعديل.

هذه الانزيمات تحفز قطع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في مواقع محددة ، بشكل متكرر وبدون استخدام طاقة إضافية. معظمها يتطلب وجود عوامل مساعدة مثل المغنيسيوم أو الكاتيونات ثنائية التكافؤ الأخرى ، على الرغم من أن البعض يحتاج أيضًا إلى ميثيونين ATP أو S-adenosyl.

في عام 1978 ، اكتشف دانييل ناثانز وأربر ويرنر وهاميلتون سميث ، الذي تم الحصول على جائزة نوبل للطب ، لاكتشاف نوكلياز المقيدة في عام 1978. اسمها عادة ما يستمد من الكائن الحي حيث لوحظ لأول مرة.

تستخدم هذه الأنزيمات على نطاق واسع في تطوير طرق استنساخ الحمض النووي وغيرها من استراتيجيات البيولوجيا الجزيئية والهندسة الوراثية. إن خصائصه في التعرف على التسلسلات المحددة والقدرة على قطع التسلسلات القريبة من مواقع التعرف تجعلها أدوات قوية في التجارب الوراثية.

يمكن استخدام الأجزاء المتولدة من إنزيمات التقييد التي عملت على جزيء DNA معين لإعادة إنشاء "خريطة" للجزيء الأصلي باستخدام معلومات حول المواقع التي قطع فيها الإنزيم الحمض النووي.

قد يكون لبعض الإنزيمات المقيدة نفس موقع التعرف على الحمض النووي ، لكنها لا تقطعها بنفس الطريقة بالضرورة. وبالتالي ، هناك إنزيمات تقوم بتخفيضات تاركة نهايات حادة وأنزيمات تقطع نهايات متجانسة ، لها تطبيقات مختلفة في البيولوجيا الجزيئية.

في الوقت الحاضر ، هناك المئات من إنزيمات التقييد المختلفة المتاحة تجاريا ، والتي تقدمها المنازل التجارية المختلفة ؛ تعمل هذه الإنزيمات مثل المقص الجزيئي "المخصص" لأغراض مختلفة.

مؤشر

• 1 وظائف
• 2 آلية العمل
• 3 أنواع
  • 3.1 النوع الأول تقييد الانزيمات
  • 3.2 النوع الثاني تقييد الانزيمات
  • 3.3 النوع الثالث تقييد الانزيمات
  • 3.4 النوع الرابع تقييد الانزيمات
  • 3.5 النوع الخامس تقييد الانزيمات
• 4 أمثلة
• 5 المراجع

وظائف

تخدم إنزيمات التقييد الوظيفة المعاكسة للبوليميرات ، حيث إنها تحلل أو تكسر رابطة الإستر داخل رابطة فوسفودايستر بين النيوكليوتيدات المجاورة في سلسلة النيوكليوتيدات.

في البيولوجيا الجزيئية والهندسة الوراثية ، تُستخدم هذه الأدوات على نطاق واسع لبناء ناقلات التعبير والاستنساخ ، وكذلك لتحديد تسلسلات محددة. كما أنها مفيدة لبناء الجينوم المؤتلف ولديها إمكانات تكنولوجية حيوية كبيرة.

تستخدم التطورات الحديثة في العلاج الجيني استخدام إنزيمات التقييد الحالية لإدخال بعض الجينات في نواقل تكون مركبات لنقل هذه الجينات إلى الخلايا الحية ، والتي من المحتمل أن يتم إدراجها في جينوم الخلية لأداء تغييرات دائمة.

آلية العمل

يمكن أن تحفز إنزيمات التقييد عملية قطع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، على الرغم من أن بعضها قادر على التعرف على تسلسل الحمض النووي المفرد والذين تقطعت بهم السبل. يحدث القص بعد التعرف على التسلسلات.

تتكون آلية العمل في التحلل المائي لسندات فوسفوديستر بين مجموعة الفوسفات وأكسيد النيتروجين في العمود الفقري لكل حبلا من الحمض النووي. يمكن للعديد من الإنزيمات أن تقطع في نفس المكان الذي تتعرف عليه ، في حين أن البعض الآخر يقطع ما بين 5 إلى 9 أزواج من القواعد قبله أو بعده..

عادةً ما يتم قطع هذه الإنزيمات عند نهاية مجموعة الفوسفات 5 '، مما يؤدي إلى ظهور شظايا من الحمض النووي مع نهاية الفسفوريل 5' 'ونهاية الهيدروكسيل الطرفي 3'.

نظرًا لأن البروتينات لا تتلامس بشكل مباشر مع موقع التعرف على الحمض النووي ، يجب أن يتم نقلها على التوالي حتى تصل إلى الموقع المحدد ، ربما عن طريق آليات "انزلاقية" على شريط DNA..

أثناء القطع الأنزيمي ، يتم وضع رابط فوسفات الأوعية لكل من فروع الحمض النووي داخل أحد المواقع النشطة لإنزيمات التقييد. عندما يترك الإنزيم موقع الاعتراف والقطع ، فإنه يفعل ذلك من خلال جمعيات عابرة غير محددة.

نوع

حاليا ، خمسة أنواع من الانزيمات تقييد معروفة. أدناه ، وصف موجز لكل:

النوع الأول تقييد الانزيمات

هذه الإنزيمات عبارة عن بروتينات خماسية كبيرة تحتوي على ثلاث وحدات فرعية ، وتقييد ، وميثيل ، وأخرى للتعرف على متواليات الحمض النووي. هذه النويدات الداخلية عبارة عن بروتينات متعددة الوظائف قادرة على تحفيز تفاعلات التقييد والتعديل ، ولها نشاط ATPase وأيضًا توبويزوميراز الحمض النووي.

كانت الإنزيمات من هذا النوع أول نوكلياز يتم اكتشافها ، وتم تطهيرها لأول مرة في الستينيات ومنذ ذلك الحين تمت دراستها بعمق كبير.

لا يتم استخدام إنزيمات النوع الأول على نطاق واسع كأداة للتكنولوجيا الحيوية ، حيث يمكن أن يكون موقع القطع على مسافة متفاوتة تصل إلى 1000 زوج أساسي من موقع التعرف ، مما يجعلها غير موثوقة من حيث إمكانية الاستنساخ التجريبي.

النوع الثاني تقييد الانزيمات

إنها إنزيمات مكونة من مثيلات متجانسة أو رباعيات تقطع الحمض النووي في مواقع محددة يتراوح طولها بين 4 و 8 نقاط أساس. مواقع القطع هذه عادة ما تكون متواضعة ، أي أنها تتعرف على تسلسلات تتم قراءتها بنفس الطريقة في كلا الاتجاهين.

العديد من الإنزيمات المقيدة من النوع الثاني في البكتيريا تقطع الدنا عندما تتعرف على شخصيتها الغريبة ، لأنها لا تمتلك التعديلات النموذجية التي يجب أن يمتلكها الحمض النووي..

هذه أبسط إنزيمات التقييد لأنها لا تتطلب أي عامل مساعد بخلاف المغنيسيوم (Mg +) للتعرف على تسلسل الحمض النووي وقطعه.

إن دقة إنزيمات تقييد النوع الثاني في التعرف على التسلسلات البسيطة في الحمض النووي وقطعها في المواضع الدقيقة تجعلها واحدة من الأكثر استخدامًا والتي لا غنى عنها في معظم فروع البيولوجيا الجزيئية.

ضمن مجموعة من النوع الثاني من الأنزيمات ، توجد فئات فرعية متعددة مصنفة وفقًا لبعض الخصائص الفريدة لكل منها. يتم تصنيف هذه الإنزيمات عن طريق إضافة أحرف الأبجدية ، من الألف إلى الياء بعد اسم الإنزيم.

بعض الفئات الفرعية الأكثر شهرة بفائدتها هي:

الفئة الفرعية IIA

هم قاتمة من وحدات فرعية مختلفة. يتعرفون على تسلسلات غير متماثلة ويستخدمون كسلائف مثالية لتوليد إنزيمات القطع.

الفئة الفرعية IIB

وهي تتألف من واحد آخر dimers وقطع الحمض النووي على جانبي تسلسل الاعتراف. لقد قطعوا كلا خيوط الحمض النووي في مجموعة من الأزواج الأساسية خارج موقع التعرف.

فئة فرعية IIC

الانزيمات من هذا النوع هي ببتيد مع وظائف الانقسام وتعديل فروع الحمض النووي. هذه الانزيمات تقطع كلا الخيوط بشكل غير متماثل.

فئة فرعية IIE

إنزيمات هذه الفئة الفرعية هي الأكثر استخدامًا في الهندسة الوراثية. لديهم موقع تحفيزي ويتطلبون عمومًا مفعول خيفي. تحتاج هذه الإنزيمات إلى التفاعل مع نسختين من تسلسل التعرف الخاص بها لإجراء خفض فعال. ضمن هذه الفئة الفرعية توجد الأنزيمات EcoRII و EcoRI.

النوع الثالث تقييد الانزيمات

تتكون نوكليازيس تقييد النوع الثالث من وحدتين فرعيتين فقط ، الأولى مسؤولة عن التعرف على الحمض النووي وتعديله ، في حين أن الآخر مسؤول عن قطع التسلسل.

تتطلب هذه الإنزيمات عاملين مساعدين لعملهما: ATP والمغنيسيوم. تمتلك إنزيمات التقييد من هذا النوع موقعين للتعرف غير المتماثل ، وتنقل الحمض النووي بطريقة تعتمد على ATP وتقطع ما بين 20 إلى 30 نقطة أساس بجوار موقع التعرف..

النوع الرابع تقييد الانزيمات

من السهل التعرف على إنزيمات النوع الرابع لأنها تقطع الدنا بعلامات مثيلة ، وتتكون من عدة وحدات فرعية مختلفة مسؤولة عن التعرف على تسلسل الحمض النووي وقطعه. تستخدم هذه الإنزيمات كعوامل مساعدة GTP والمغنيسيوم ثنائي التكافؤ.

تشمل المواقع المحددة للقطع سلاسل النيوكليوتيدات مع بقايا السيتوزين الميثلي أو الميثيلوكسي ميثيل في واحد أو كلا خيوط الأحماض النووية.

النوع الخامس تقييد الانزيمات

يقوم هذا التصنيف بتجميع أنزيمات نوع CRISPER-Cas ، والتي تحدد وتقطع تسلسلات DNA محددة من الكائنات الغازية. تستخدم إنزيمات Cas حبلاً من كريسبر RNA الموجّه لتعرّف ومهاجمة الكائنات الغازية.

إن الإنزيمات المصنفة كنوع V عبارة عن polypeptides مرتبة حسب أنواع الإنزيمات من النوع الأول والثاني والثاني. يمكنهم قطع أجزاء من الحمض النووي لأي كائن حي تقريبًا وبمدى كبير من الطول. إن مرونتها وسهولة استخدامها تجعل هذه الإنزيمات واحدة من أكثر الأدوات شيوعًا في الهندسة الوراثية اليوم إلى جانب أنزيمات النوع الثاني.

أمثلة

تم استخدام إنزيمات التقييد للكشف عن أشكال الحمض النووي ، وخاصة في دراسات الوراثة السكانية والدراسات التطورية باستخدام الحمض النووي للميتوكوندريا ، من أجل الحصول على معلومات حول معدلات بدائل النوكليوتيدات..

في الوقت الحاضر ، فإن المتجهات المستخدمة لتحويل البكتيريا ذات الأغراض المختلفة لها مواقع متعددة الجلطات حيث توجد مواقع التعرف على إنزيمات التقييد المتعددة..

من بين هذه الإنزيمات ، أكثرها شعبية هي EcoRI ، II ، III ، IV و V ، تم الحصول عليها ووصفها لأول مرة كولاي. هنديي ، من H. الانفلونزا وبامى B. amyloliquefaciens.

مراجع

1. Bickle، T. A.، & Kruger، D. H. (1993). بيولوجيا تقييد الحمض النووي. الميكروبيولوجية الاستعراضات, 57(2) ، 434-450.
2. Boyaval، P.، Moineau، S.، Romero، D. A.، & Horvath، P. (2007). كريسبر يوفر المقاومة المكتسبة ضد الفيروسات في بدائيات النوى. علم, 315(مارس) ، ١٧٠٩-١٧١٣.
3. Goodsell، D. (2002). المنظور الجزيئي: تقييد النواة الداخلية. الخلايا الجذعية أساسيات طب السرطان, 20, 190-191.
4. هالفورد ، س. (2001). التنقل ، والقفز ، وحلقات عن طريق تقييد الانزيمات. معاملات مجتمع الكيمياء الحيوية, 29, 363-373.
5. جيلتش ، أ. (2003). الحفاظ على هوية الأنواع والتحكم في نوع البكتيريا: وظيفة جديدة لأنظمة التقييد / التعديل? جينة, 317, 13-16.
6. كريبس ، ج. ، جولدشتاين ، إي ، و كيلباتريك ، س. (2018). جينات لوين الثاني عشر (12 إد.) بيرلينجتون ، ماساتشوستس: جونز وبارتليت التعلم.
7. Li، Y.، Pan، S.، Zhang، Y.، Ren، M.، Feng، M.، Peng، N.، ... She، Q. (2015). تسخير النوع الأول والنوع الثالث من أنظمة CRISPR-Cas لتحرير الجينوم. بحوث الأحماض النووية, 1-12.
8. Loenen، W. A.M.، Dryden، D.T. F.، Raleigh، E.A، & Wilson، G.G. (2013). النوع الأول تقييد الانزيمات وأقاربهم. بحوث الأحماض النووية, 1-25.
9.  Nathans، D.، & Smith، H. O. (1975). تقييد نوكلياز في تحليل وإعادة هيكلة جزيئات الحمض النووي. أنو. القس Biochem., 273-293.
10.  Nei، M.، & Tajima، F. (1981). تعدد الأشكال الحمض النووي للكشف عن طريق تقييد نوكلياز تقييد. علم الوراثة, 145-163.
11.  Pingoud، A.، Fuxreiter، M.، Pingoud، V.، & Wende، W. (2005). العلوم الحياتية والجزيئية للحياة من النوع الثاني من الخلايا النووية: البنية والآلية. CMLS علوم الحياة الخلوية والجزيئية, 62, 685-707.
12.  روبرتس ، ر. (2005). كيف أصبحت الانزيمات المقيدة هي سلالات البيولوجيا الجزيئية. PNAS, 102(17) ، 5905-5908.
13.  روبرتس ، ر. جي ، وموراي ، ك. (1976). تقييد النويدات. مراجعات نقدية في الكيمياء الحيوية, (نوفمبر) ، 123-164.
14.  Stoddard، B. L. (2005). صاروخ موجه نوكلياز هيكل وظيفة. المراجعات الفصلية للفيزياء الحيوية, 1-47.
15.  Tock، M. R.، & Dryden، D. T. F. (2005). بيولوجيا التقييد ومكافحة التقييد. الرأي الحالي في علم الأحياء الدقيقة, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16.  Wilson، G. G.، & Murray، N. E. (1991). أنظمة التقييد والتعديل. أنو. القس جينيت., 25, 585-627.
17.  Wu، Z.، & Mou، K. (2016). رؤى الجينوم في الفوعة Campylobacter jejuni وعلم الوراثة السكانية. إصابة. ديس. ترجمة. ميد., 2(3) ، 109-119.
18.  يوان ، ر. (1981). هيكل وآلية نوكلياز تقييد متعدد الوظائف. أنو. القس Biochem., 50, 285-315.