الحمض النووي تسلسل ماكسام جيلبرت ، طريقة سانجر ، أمثلة

ال تسلسل الحمض النووي (حمض الديوكسي ريبونوكلييك) هو إجراء يتم إجراؤه في مختبرات البيولوجيا الجزيئية والذي يسمح بمعرفة ترتيب النيوكليوتيدات في المادة الوراثية محل الاهتمام. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا الكشف عن تسلسل الحمض النووي الريبي (الحمض النووي الريبي).

هذه التقنية لا غنى عنها لتطوير العلوم البيولوجية. كما ينطبق على مجالات المعرفة الأخرى - مثل التشخيص الطبي والتحقيقات الجنائية ، على سبيل المثال.

في السابق ، كان تسلسل سلسلة من الحمض النووي يعتبر نشاطًا بطيئًا ومكلفًا ، مما سمح بتحديد بضعة أزواج قاعدية فقط في أليغنوكليوتيدات.

في الوقت الحاضر ، مع كل التطورات العلمية ، تعد تسلسل الحمض النووي عملية روتينية في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم بفضل مساهمة ما يقرب من 50 عامًا من البحث في هذا المجال. بالنسبة لطول السلسلة ، يمكنك التسلسل إلى ملايين الأزواج الأساسية في وقت قصير جدًا.

للقيام بذلك ، هناك العشرات من التقنيات المتقدمة التي تختلف في السعر والدقة. في هذه المقالة ، سنصف التقنيات الكلاسيكية والحديثة ، ولكل منها مزاياها وعيوبها.

حتى الآن ، تسمح تقنيات التسلسل بالحصول على تسلسل الجينومات الكاملة ، من بدائيات النوى الصغيرة والخمائر إلى الجينوم البشري.

مؤشر

• 1 هيكل الحمض النووي
• 2 التاريخ
• 3 طريقة سانجر
  • 3.1 المكونات الرئيسية للتفاعل
  • 3.2 قراءة النتائج
• 4 التسلسل التلقائي
• 5 ماكسام جيلبرت التسلسل
  • 5.1 الإجراء
  • 5.2 قراءة النتائج
• 6 التسلسل الضخم
  • 6.1 الانحلال
  • 6.2 التسلسل بالتوليف
  • 6.3 التسلسل بالربط
  • 6.4 التسلسل ايون السيل
• 7 أمثلة
  • 7.1 تسلسل الجينوم البشري
• 8 الأهمية والتطبيقات
• 9 المراجع

هيكل الحمض النووي

لفهم الطرق والتقنيات المستخدمة لتسلسل الحمض النووي ، من الضروري معرفة بعض الجوانب الرئيسية لبنية الجزيء وتكوينه.

الحمض النووي هو جزيء حيوي موجود في جميع الكائنات الحية ، من البكتيريا إلى الحيوانات المائية الكبيرة. تحتوي العضيات - مثل الميتوكوندريا والبلاستيدات الخضراء - على جزيء DNA دائري بداخلها. حتى في بعض الفيروسات ، فإن المادة الوراثية الموجودة هي الحمض النووي.

من الناحية الهيكلية ، الحمض النووي عبارة عن مجموعة من النيوكليوتيدات. يتم دمج كل واحد بواسطة الكربوهيدرات ، وقاعدة النيتروجين (A ، T ، C أو G) ومجموعة الفوسفات. الهدف من تسلسل الحمض النووي هو الكشف عن الترتيب الذي توجد به القواعد النيتروجينية الأربعة في التسلسل.

تاريخ

في منتصف الخمسينيات ، وصف الباحثان واتسون وكريك بنية الحمض النووي باستخدام تقنيات كرستولوجية. ومع ذلك ، لم يتمكن أي من هؤلاء الباحثين من إيجاد طريقة لكشف التسلسل.

على الرغم من وجود أسلاف معينة ، كان الحدث الأكثر أهمية هو إنشاء طريقة سانجر ، في عام 1977. كان فريدريك سانجر ، والد الطريقة ، عالم الكيمياء الحيوية البريطاني ، الحائز على جائزتين نوبل عن مساهماته الهائلة في العلوم البيولوجية.

تُعرف هذه التقنية أيضًا في الأدب باسم "إنهاء السلسلة" أو الديوكسين النيوكليوتيدات. بعد ذلك سوف نصف مبادئ هذه التقنية وتلك التي تم تطويرها بناءً على تحسين وابتكار هذا.

طريقة سانجر

يمثل تطوير طريقة سانجر حدثًا حاسمًا في البيولوجيا الجزيئية. وهو يشمل المكونات الأساسية لعملية تكرار الحمض النووي التي تحدث عادة في الخلية ، ولكن عن طريق إضافة عنصر خاص: ديديوكسينوكليوتيدات.

المكونات الرئيسية للتفاعل

- بوليميريز الحمض النووي: إنزيم بوليميريز الحمض النووي هو عنصر حاسم في هذه العملية. يشارك هذا الجزيء في تكرار شرائط الحمض النووي ودوره هو تخليق السلسلة الجديدة ، التي تتطابق مع ثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونكليوتيدات مع العناصر التكميلية.

تذكر أنه في الحمض النووي ، يتم إقران الثيمين (T) مع الأدينين (A) عن طريق اثنين من روابط الهيدروجين ، في حين أن السيتوزين (C) يفعل مع الجوانيين (G) بثلاثة جسور.

- النيوكليوتيدات: يتضمن تسلسل سانجر نوعين من النيوكليوتيدات ، أربعة النوكليوتيدات الأربعة 2'ق (اختصار كـ dATP ، dGTP ، dCTP و dTTP) و dideoxynucleotides الأربعة (ddATP ، ddGTP ، ddCTP و ddTTP).

على الرغم من أن ديوكسين النيوكليوتيدات يشبه المونومرات التي يتم دمجها عادة في الحمض النووي ، إلا أنها تفتقر إلى مجموعة -OH في بنيتها. هذا يجعل من المستحيل إضافة نيوكليوتيد جديد إلى السلسلة.

لذلك ، عند إضافة نكليوتيد خاص - بطريقة عشوائية تمامًا - إلى السلسلة المكونة ، يكون التوليف مشلولًا. وبهذه الطريقة ، في نهاية التفاعل ، توجد سلاسل بأحجام مختلفة ، كل منها تم إيقاف التفاعل عند نقطة مختلفة.

من الناحية التجريبية ، تم إعداد أربع تجارب. يحتوي كل منها على الحمض النووي المستخرج من العينة البيولوجية المهمة ، النيوكليوتيدات الطبيعية وأحد الأنواع الأربعة من النيوكليوتيدات الخاصة. أو تتميز النيوكليوتيدات الخاصة بنوع من علامات الفلورسنت (انظر أدناه التسلسل الآلي).

قراءة النتائج

تتمثل الخطوة الأولى في فصل كل من السلاسل المركبة وفقًا لحجمها. سيكون بعضها أطول من غيرها ، اعتمادًا على المكان الذي تم فيه دمج القواعد الخاصة.

هناك تقنيات كيميائية حيوية مختلفة تسمح بفصل مكونات الخليط باستخدام الحجم كخاصية تمييزية. في طريقة سانجر ، يتم فصل السلاسل المختلفة عن طريق الكهربائي. في المتغيرات الأكثر تطورا من هذه التقنية ، يتم استخدام الكهربائي الشعري.

وبالتالي ، فإن الأطوال الأطول تتحرك أقل من المتغيرات الأقصر. ثم ، يمر هذا النظام من خلال قارئ يتعرف على العلامة المضمنة في كل ديديوكسين نيوكليوتيد. بهذه الطريقة ، يمكن معرفة ترتيب التسلسل.

هذه التقنية "الجيل الأول" قادرة على قراءة شظايا الحمض النووي لا يزيد حجمها عن 1 كيلو بايت. في الوقت الحاضر ، يتم استخدام طريقة سانجر في العديد من المختبرات ، بشكل عام في المتغيرات الحديثة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدامه لتأكيد النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام التقنيات الأكثر تعقيدًا - ولكن أقل دقة.

التسلسل التلقائي

عندما يكون التسلسل واسع النطاق ضروريًا ، يتم تسريع العملية عن طريق الأتمتة. هذا هو الاختلاف في طريقة إنهاء سلسلة Sanger ، حيث يتم تمييز الاشعال بمنتجات الفلورسنت من أجل تمييزها.

بعد ذلك ، يتم تشغيل ناتج التفاعل في رحلان كهربائي - كل ذلك في ممر واحد. عندما تترك كل جزء الجزء الأخير من الجل ، يتم التعرف عليه بسرعة بواسطة ملصق الفلورسنت ، مع وجود خطأ يحيط بنسبة 1٪.

تحتوي الأنظمة الأكثر تطوراً على نظام يصل إلى 96 أنبوبًا شعريًا يتم تشغيله بواسطة كمبيوتر إلى جانب روبوت. وهذا هو ، 96 عينات الحمض النووي يمكن تقييمها في وقت واحد. وبالتالي ، فإن العملية التي تنطوي على رحلان كهربائي وتحليل النتائج تتم آليا بالكامل.

في يوم واحد ، يمكن لهذه النظم تسلسل ما يصل إلى 550،000 قواعد. خلال هذه العملية ، العمل البشري غير ضروري ، لا يستغرق الأمر سوى 15 دقيقة لبدء العملية.

التسلسل بواسطة ماكسام جيلبرت

في الوقت نفسه الذي نشر فيه سانجر عمله ، تمكن باحثان يدعيان آلان ماكسان ووالتر جيلبرت من تطوير طريقة أخرى للحصول على تسلسل الحمض النووي. اكتسبت هذه الطريقة شعبية في ذلك الوقت ، ولكن تم استبدالها لاحقًا بتحسين طريقة سانجر.

خلافًا لطريقة سانجر ، فإن تسلسل ماكسان وجيلبرت (أو التسلسل الكيميائي ، كما هو معروف أيضًا) لا ينطوي على تفاعلات تهجين. تتكون المنهجية من الوسم مع العوامل التفاعلية في نهاية واحدة ، تليها عملية تنقية.

يكمن أحد الجوانب السلبية لهذه التقنية في تعقيدها الهائل واستخدام المواد الكيميائية التي تشكل خطورة على المستخدم. تحدث الأعطال الكيميائية عن طريق تطبيق DMS ، وحمض الفورميك ، وهيدرازين وهيدرازين مع الأملاح..

عملية

يبدأ البروتوكول بالوسم في الطرف الخامس من الشريط بعلامة الفوسفور 32 ، ثم يحدث تعديل كيميائي للقاعدة النيتروجينية ويتم فصله. وأخيرا يحدث انقسام في المنطقة العباسية.

أولاً يتم تقصير السلسلة المراد تسلسلها إلى مقاطع أصغر. يتم تنفيذ هذه الخطوة مع إنزيمات تقييد ، والتي تؤدي إلى تطرف المعلقة.

بعد ذلك ، يتم التفاعل باستخدام فوسفاتيز قلوي ، والذي يهدف إلى القضاء على مجموعة الفوسفات. وبالتالي ، يمكن استخدام كينيز متعدد النيوكليوتيد لأداء الملصقات.

تم تغيير طبيعة السلسلة (الفتحتان مفتوحتان). ثم ننتقل إلى تطبيق المواد الكيميائية. تتم تفاعلات الانقسام هذه بطريقة محكومة وأنواع الروابط التي يتم تكسيرها بواسطة كل مادة كيميائية مطبقة.

قراءة النتائج

كما هو الحال في طريقة سانجر ، تتضمن قراءة النتائج الفصل حسب حجم السلاسل التي يتم الحصول عليها في نظام رحلان كهربائي. تسمح الأنظمة المكونة من بولي أكريلاميد بالحصول على دقة كافية لقراءة الجل.

التسلسل الضخم

يشمل التسلسل الضخم سلسلة من الأساليب الجديدة ، والمختصرة باسم NGS ، من الإنجليزية "تسلسل الجيل التالي ".

تتطلب الطرق المفهرسة كـ NGS خطوة سابقة لتضخيم الحمض النووي (وهي لا تعمل مع جزيء واحد). بالإضافة إلى ذلك ، تختلف المنصات المستخدمة على نطاق واسع. سيتم شرح مبادئ الطرق الأكثر شعبية أدناه:

سلسلة البايرو

إنه ينطوي على مراقبة إطلاق البيروفوسفات ، والذي يحدث في كل مرة تضاف فيها النيوكليوتيدات الجديدة إلى شريط DNA. يقترن نظام الإنزيم ، بحيث يحدث انبعاث الضوء (والذي يمكن اكتشافه بواسطة الكاميرا) في كل مرة يتم فيها دمج نيوكليوتيد جديد.

تبدأ العملية بحضانة منفصلة لكل قاعدة نيتروجينية للتحقق من وجود انبعاث ضوئي أم لا. Pyrosequencing يمكن أن تؤدي قراءة خيوط طويلة ، ولكن معدل الخطأ وجدت عالية.

التسلسل بالتوليف

وهذا ينطوي على دمج النيوكليوتيدات المسمى. تتم إضافة هذه المكونات الفلورية وغسلها ، ويلاحظ النوكليوتيدات المدمجة. بعد ذلك ، يتم التخلص من وضع العلامات على النوكليوتيدات ، ويمكن أن يستمر تركيب الشريط. في الخطوة التالية ، سيتم أيضًا تضمين النيوكليوتيد المسمى ، وسيتم تكرار الخطوات المذكورة.

عيب واحد مع هذه التقنية يحدث عندما لا يتم القضاء تماما علامات الفلورسنت. هذه الانبعاثات تخلق أخطاء في الخلفية ، مما يؤدي إلى أخطاء كبيرة.

التسلسل عن طريق ربط

هذه التقنية تختلف عن غيرها ، لأنها لا تستخدم بوليميريز الحمض النووي. بدلا من ذلك ، فإن الإنزيم الرئيسي لهذه المنهجية هو ligase. هنا يتم استخدام شظايا الحمض النووي التي تحمل علامات الفلورسنت ، وهي مرتبطة بالإنزيم ويتم اكتشافه.

أكبر مشكلة في هذه التقنية هي الطول القصير جدًا للجزء الذي يمكن معالجته.

ايون التسلسل تورنت

تعتمد هذه التقنية على قياس أيون H⁺ التي يتم إصدارها في كل مرة يتم دمج النوكليوتيدات الجديدة. هذا المبدأ مشابه تمامًا للتأثيرات الحرارية ، ولكنه أرخص بكثير.

أمثلة

تسلسل الجينوم البشري

كان تسلسل جينوم البشر أحد أكثر التحديات الواعدة في علم الأحياء ، فضلاً عن كونه أحد أكثر المنافسين شهرة في تاريخ العلوم. في الواقع ، بالنسبة للعلماء المشاركين في المشروع ، أصبح تسلسل الجينوم منافسة.

في عام 1990 بدأ ما يسمى "مشروع الجينوم البشري" ، بقيادة العالم الشهير ، الحائز على جائزة نوبل ، جيمس واتسون. بعد عام واحد ، في عام 1991 ، واجه فنتر تحدي "ضرب" واتسون وتسلسل الجينوم قبله. ومع ذلك ، في عام 1992 ، تقاعد واتسون وتولى الأمر باحث آخر.

في عام 1995 أعلن Venter نجاحه في التسلسل الكامل لجينوم بكتيري بطريقة التسلسل العشوائي. وبالمثل ، أعلن الفريق الآخر بعد عام تسلسل جينوم الخميرة.

في عام 2000 تم إنهاء السباق. نشرت كلتا الشركتين نتائجها الأولية للجينوم الكامل في اثنين من المجلات المرموقة في العلوم: طبيعة و علم.

ومع ذلك ، واصل العلماء العمل على تحسين المقترحات ، وفي عام 2006 تم الانتهاء من تسلسل بعض الكروموسومات البشرية.

الأهمية والتطبيقات

معرفة ترتيب النيوكليوتيدات في جزيء مهم مثل الحمض النووي أمر مهم لعلماء الأحياء والمهنيين ذوي الصلة. تحتوي هذه السلسلة من النيوكليوتيدات على جميع المعلومات اللازمة لتطوير وصيانة جميع أشكال الحياة.

لهذه الأسباب ، فإن معرفة هذا التسلسل ضروري للبحث البيولوجي. في الأساس ، يسمح لنا التسلسل بقياس واحدة من أهم خصائص النظم البيولوجية وإقامة فروق بينها.

يستخدم التسلسل على نطاق واسع من قبل علماء التصنيف وعلماء النظام ، حيث أن تسلسلات معينة من الحمض النووي تسمح بوضع معايير لاستنتاج ما إذا كان كائنان ينتميان إلى نفس النوع أم لا ، وكذلك القدرة على اقتراح فرضيات حول العلاقات التطورية بينهما..

بالإضافة إلى ذلك ، فإن تسلسل الحمض النووي له تطبيقات في مجال الطب والتشخيص. على سبيل المثال ، هناك أنظمة ميسورة التكلفة ويمكن الوصول إليها ، من خلال التسلسل ، تسمح لنا بتقييم الميل إلى تطوير أمراض معينة (مثل السرطان) باستخدام أشكال متعددة النوكليوتيدات البسيطة (SNP)..

كما تم إثراء التحقيقات من النوع الجنائي والطب الشرعي بتقنيات التسلسل ، ويمكن استخدامها كدليل موثوق على مشاركة فرد معين في جريمة ما..

مراجع

1. هيذر ، J. M. ، وسلسلة ، B. (2016). تسلسل المتسلسلات: تاريخ تسلسل الحمض النووي. علم الجينوم, 107(1) ، 1-8.
2. Koboldt، D.C.، Steinberg، K.M، Larson، D.E، Wilson، R.K.، & Mardis، E.R. (2013). الجيل القادم من ثورة التسلسل وتأثيره على الجينوم. خلية, 155(1) ، 27-38.
3. ليفي ، جيه (2010). التنافس العلمي. من جاليليو إلى مشروع الجينوم البشري. بارانينفو الافتتاحية.
4. Sanger، F.، Nicklen، S.، & Coulson، A. R. (1977). تسلسل الحمض النووي مع مثبطات إنهاء سلسلة. وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم, 74(12) ، 5463-5467.
5. Schuster، S. C. (2007). تسلسل الجيل القادم يحول بيولوجيا اليوم. طرق الطبيعة, 5(1) ، 16.
6. شو ، ج. (2014). تسلسل الجيل التالي. Caister Academic Press.